让细胞计数更加准确的7个步骤 | 单细胞专题
对于每种细胞计数方法，样品表面必须是干净的。
任何污染都可能导致不准确的结果。
对于人工细胞计数，这包括移除和清洁玻璃盖片，然后用70%乙醇然后用水清洁计数腔。
当使用一次性塑料载玻片时，每个样品都需要一个新的载玻片(如果载玻片有两个分开的腔室，则需要一对样品)。
在装载样品之前立即进行漩涡震荡处理，是确保被分析样品具有代表性的重要步骤。
不同大小和类型的细胞将以不同的速率沉降和聚集。在加载样品之前立即旋转溶液会增加等分的概率，并准确地反映细胞培养的特性。
细胞计数需要对整个细胞悬液中的少量样本进行分析，因此必须注意确保样品能够代表原始整个单细胞悬液。联川生物使用台盼蓝Countess法和荧光计数Countstar法以及最原始的血球计数板法等多种方法来对细胞活性进行监控和计算。
包括Countstar有采用荧光法，所以像是Countstar这样的细胞计数器应用算法来识别活细胞或死细胞，但它们不能对不具代表性的样本进行校正。
当手动计数时，与单个细胞相比，细胞成团率/结团率的评分更具主观性，从而增加了可变性。细胞裂解后的细胞向外释放的DNA（会造成粘稠结团））和细胞碎片是结团的常见原因。
细胞裂解可能是由于过度生长、过度移液的机械剪切或冷冻/解冻循环等因素造成的，而胰蛋白酶消化不足或过度也可能导致样品的异质性。
目前为了降低细胞结团率，联川生物通过温和细胞裂解的方式来进行尝试，以防止过为剧烈的酶解方式会导致细胞凋亡过快从而释放更多的DNA。如胰酶等需要谨慎使用。
另外对细胞碎片的样本进行过滤，甚至是过滤膜等方式，均可以减少细结团率。
无论是手动计数还是依靠Countess和Countstar等自带软件算法计数，调整焦距和曝光设置都很重要，以确保细胞尽可能有比较好的可见性/能见度，最终获得最准确的细胞计数结果。
最佳的聚焦和曝光将在细胞膜和背景之间，有非常非常非常鲜明的对比。
如上图所示，最佳的聚焦方面，左侧属于正确的聚焦。但是右侧的图为错误的聚焦方式，聚焦不充分。
所以在使用荧光计数之前，条件允许下需要单独优化每个荧光通道的能力，并将产生最具重复性的结果，来检验这种调整优化后荧光细胞计数仪的复现性和稳定性。
实验室应该设置荧光强度，以确保细胞尽可能明亮，同时保持其真实大小-不应该有光从细胞的边缘渗出。
血球计数板有多种型号规格可供选择。不同型号的腔室高度和深度在设计上都差异巨大。实验人员在计算细胞数量时要注意一些细节以避免错误。
大多数自动细胞计数仪都可以调整各种设置参数，以便与正在研究的细胞最佳匹配。
例如，可以设置和保存细胞大小范围，以便将碎片或其他细胞群排除在分析之外。像Countstar等计数仪，可以用PBMC、Vero等细胞作为标准参考。
视野范围内的亮度分析以有效地对培养的哺乳动物细胞进行计数。
然而，即便是使用台盼蓝都很难区分活细胞和死亡细胞，尤其是对许多原代细胞来说，需要使用荧光计数法。
例如，PBMC通常与大量的红细胞混合在一起，通过一般的亮度分析，这些红细胞可能会显示为“死亡”。然而，使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)等染料，可以只对有核的PBMC进行染色，并通过双重荧光区分活细胞和死细胞。
AO和PI都可以对核酸进行染色，但只有AO能够穿过活细胞膜。
最终活的PBMC被AO染色，并呈现荧光绿，死的PBMC同时被AO和PI染色，呈现荧光红。但红细胞没有染色，根本没有发出荧光。
卓林钢，负责上海地区业务，2016年毕业于华东师范大学生物医学研究所；
已经合作的客户单位有上海交通大学医学院，上海交通大学医学院瑞金医院，上海交通大学医学院仁济医院，华东师范大学，上海市第一人民医院，第二军医大学，上海长征医院，上海龙华医院，复旦肿瘤医院，上海计生所医院等.......
从科研一线的工作者转变为科研服务的高通量测序行业的一线销售人员，多年的实验经验让我能够更好的和各位老师或是同学沟通，也更容易理解课题设计的关键点。经过了近半年的新冠疫情的考验和沉淀，2020年下半年希望更好的服务于各位老师，希望自己在工作的过程中也全面提升。
在联川，学习和体会到了很多东西
本身有多年疾病动物实验的经验，然后来联川后近距离的了解学习各类组学，高通量测序方面的知识，结合自身生物学知识，时常可以给客户一些小的建议或是探讨一下课题的关键点，更好的推进课题进展。另外因为有多年的organoid培养的经验，类器官也是很好的一个研究工具，如果有老师有意开展这方面工作的话，欢迎联系我交流。
入职联川以来感受最深的就是同事间乐于相互帮助，充满活力，对于每一个客户项目都认真负责，部门间相互协作，精诚合作，很快能帮客户给出方案，解决问题，给客户最好的服务
总之来到联川之后，我也学习成长了很多，相信在未来的时间里，自己会进步成长的更快。在未来的日子里，更加努力工作，做好服务，业绩更近一步，也祝愿各位老师的科研工作顺利，做出更多更好的工作。
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